Громова О.А.1 , Торшин И.Ю.1 , Лила А.М.2 , Наумов А.В.3 , Рейер И.А.1 , Каратеев А.Е.2
1 Институт фармакоинформатики ФИЦ «Информатика и управление», РАН, Москва, Россия;
2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой», Москва, Россия; 3 Российский геронтологический научно-клинический центр, Москва, Россия
1 119333, Москва, ул. Вавилова, 40;
2 115522, Москва, Каширское шоссе, 34А;
3 129226, Москва, ул. 1-я Леонова, 16
Глюкозамина сульфат (ГС) необходим для регенерации хрящевой ткани, кроме того, он обладает противовоспалительными свойствами, сравнимыми с таковыми нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Клинические исследования указывают на синергизм действия ГС и НПВП при остеоартрите (ОА) и при других заболеваниях суставов.
Цель исследования – оценка степени синергизма различных комбинаций ГС и НПВП.
Материал и методы. Проведен дифференциальный хемореактомный анализ эффектов ГС и семи средств класса НПВП (кеторолак, нимесулид, диклофенак, мелоксикам, декскетопрофен, целекоксиб, эторикоксиб) для определения степени синергизма различных комбинаций ГС и НПВП.
Результаты и обсуждение. Показано, что декскетопрофен (и в меньшей степени кеторолак) наиболее эффективно усиливают противовоспалительные свойства ГС. Для использования на практике рекомендован следующий подход: на 1-й неделе лечения для быстрого устранения болевого синдрома назначается наиболее эффективная комбинация – ГС + декскетопрофен (либо ГС + кеторолак), после чего можно использовать комбинацию ГС с НПВП, прием которого в течение более длительного времени сопряжен с минимальными побочными эффектами.
Выводы. Результаты исследования показали, что совместное использование ГС и НПВП при патологии суставов является перспективным.
Ключевые слова: глюкозамина сульфат; сустагард артро; кеторолак; нимесулид; декскетопрофен; мелоксикам; диклофенак; целекоксиб; эторикоксиб; интеллектуальный анализ данных.
Контакты: Ольга Алексеевна Громова; unesco.gromova@gmail.com
Для ссылки: Громова ОА, Торшин ИЮ, Лила АМ и др. Дифференциальный хемореактомный анализ глюкозамина сульфата и нестероидных противовоспалительных препаратов: перспективные синергичные комбинации. Современная ревматология. 2018;12(2):36–43.
Differential chemoreactome analysis of glucosamine sulfate and non-steroidal anti-inflammatory drugs: promising synergistic drug combinations
Gromova O.A.1 , Torshin I.Yu.1 , Lila A.M.2 , Naumov A.V.3 , Reier I.A.1 , Karateev A.E.2
1 Institute of Pharmacoinformatics, Federal Research Center «Informatics and Control», Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia;
2 V.A. Nasonova Research Institute of Rheumatology, Moscow, Russia;
3 Russian Gerontology Research and Clinical Center, Moscow, Russia
1 40, Vavilov St., Moscow 119333;
2 34A, Kashirskoe Shosse, Moscow 115522;
3 16, First Leonov St., Moscow 129226
Glucosamine sulfate (GS) is essential for the regeneration of cartilaginous tissue and, in addition, it has anti-inflammatory properties comparable to those of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Clinical trials indicate the synergism between GS and NSAIDs in osteoarthritis (OA) and other joint diseases.
Objective: to estimate the degree of synergism between different combinations of GS and NSAIDs.
Material and methods. A differential chemoreactome analysis was employed to evaluate the effects of GS and seven agents from the class of NSAIDs, such as ketorolac, nimesulide, diclofenac, meloxicam, dexketoprofen, celecoxib, and etoricoxib, for estimating the degree of synergism between different combinations of GS and NSAIDs.
Results and discussion. Dexketoprofen is shown to enhance most effectively the anti-inflammatory properties of GS as compared to ketorolac that does this to a lesser extent. The drug should be practically used as follows: the most effective combination (GS + dexketoprofen (or GS + ketorolak) is taken at week 1 of treatment for rapid pain elimination; thereafter there may be a combination of GS and NSAIDs, the intake of which is associated with minimal adverse reactions for a longer time.
Conclusion. The investigation has shown that the coadministration of GS and NSAIDs is promising in treating joint diseases.
Keywords: glucosamine sulfate; sustaquard artro; ketorolac; nimesulide; dexketoprofen; meloxicam; diclofenac; celecoxib; etoricoxib; database mining.
Contact: Olga Alekseevna Gromova; unesco.gromova@gmail.com
Глюкозамина сульфат (ГС) и хондроитина сульфат (ХС) служат не только «строительным материалом» для восстановления соединительной ткани хряща, но и проявляют выраженные противовоспалительные свойства, сравнимые с эффектами нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Клинические исследования указывают на синергизм действия ГС и НПВП при остеоартрите (ОА) и других заболеваниях суставов [1–5]. Молекулярные механизмы действия ГС/ХС включают активацию белков-рецепторов CD44, TLR4 и ICAM1 на поверхности хондроцитов, инактивацию провоспалительного транскрипционного фактора NF-кВ и др. [1].
Ингибирование эффектов провоспалительного фактора транскрипции NF-kB и провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли (ФНО) α – основные молекулярные механизмы осуществления эффектов ГС. В норме NF-кВ практически не связывается с ДНК хондроцитов, поэтому сигнальные каскады воспаления в ткани хряща не активируются.
В экспериментальной модели коллаген-индуцированного артрита связывание NF-кВ с ДНК хондроцитов значительно увеличивалось [2]. ГС ингибирует эффекты провоспалительного белка NF-kB посредством связывания с основным таргетным белком ГС – рецептором CD44 (рис. 1). Взаимодействуя с белком CD44, ГС активирует внутриклеточные сигнальные процессы и влияет на синтез других белков протеома.
Активация рецептора CD44 молекулами ГС способствует предотвращению деградации белка IκBα, ингибирующего провоспалительный белок NF-kB [3]. Взаимодействуя с регулятором IκBα, NF-kB не может перемещаться в клеточное ядро и активировать экспрессию генов, участвующих в воспалительной реакции (см. рис. 1).
NF-кВ является одним из центральных медиаторов воспаления, так что его инактивация стимулирует снижение уровней биомаркеров воспаления интерлейкина (ИЛ) 1, ИЛ6, ФНОα, СРБ и др. [4, 5]. Кроме того, активация молекулой ГС рецептора CD44 приводит к снижению избыточного уровня матриксных металлопротеиназ (ММП), в том числе за счет регуляции транскрипции соответствующих генов.
Молекулярные механизмы синергизма ГС и НПВП в терапии патологии суставов являются основой для разработки новых перспективных протоколов лечения с одновременным использованием этих препаратов. Цель исследования – методом дифференциального хемоинформационного анализа провести сравнительную оценку фармакологических эффектов микрокристаллической фармацевтической субстанции ГС натрия хлорида («Биоиберика С.А.У.», Испания) в составе препарата Сустагард® Артро1 и НПВП и на основании различий в профилях фармакологической активности ГС и НПВП выделить наиболее перспективные комбинации, в которых оба действующих начала максимально эффективно дополняют друг друга.
Материал и методы. Исследование проводилось с использованием важного направления постгеномной фармакологии [6] – хемореактомного моделирования. Процедура анализа основана на новейших технологиях машинного обучения, разрабатываемых в рамках теории комбинаторного анализа разрешимости и теории метрического анализа признаковых описаний [7–10].
Для определения степени синергизма различных комбинаций ГС и НПВП выполнен дифференциальный хемореактомный анализ молекулы ГС в сравнении с семью НПВП (кеторолак, нимесулид, диклофенак, мелоксикам, декскетопрофен, целекоксиб, эторикоксиб). Для проведения хемоинформационного анализа был разработан новый математический метод, основанный на комбинаторной теории разрешимости [8], на основании которого вычисляется химическое расстояние dχ (X1, X2) между двумя произвольными молекулами (X1 и X2). Разработанный нами способ вычисления dχ был использован для решения задачи поиска молекул, структурно схожих с исследуемыми молекулами. Таким образом, на первом этапе хемоинформационного анализа устанавливали список наиболее близких к ГС и НПВП химических структур из базы данных PubChem [11]. На втором этапе проводили собственно хемореактомный анализ, т. е. оценку различных биологических активностей молекул.
Результаты и обсуждение. В ходе хемореактомного анализа для анализируемых молекул были получены оценки более 4500 биологических активностей, осуществляемых в рамках реактома человека. Данные активности были разделены на пять подразделов: 1) ингибирование белков метаболизма простагландинов и лейкотриенов; 2) ингибирование эффектов транскрипционного фактора NF-kB и ФНОα; 3) противовоспалительные эффекты на клетках в культуре по отношению к различным цитокинам; 4) ингибирование различных ММП; 5) вазодинамические и антидиабетические эффекты на клетках в культуре.
Затем были выбраны репрезентативные активности, представленные в таблице 1 и 2
В табл. 1 приведены хемореактомные оценки ингибирования белков метаболизма простагландинов и лейкотриенов. Хемореактомный анализ показал, что ГС является слабым ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ) 2, важного таргетного белка всех НПВП (ингибирование на 13,5%, IC50=2006 нМ). Естественно, эффекты НПВП в отношении ЦОГ2 гораздо более выражены – ингибирование достигает 35–90% (см. табл. 1). В свою очередь, ГС частично ингибирует ЦОГ1 (13,7%, IC50=1932 нМ), причем эффекты сравнимы с действием исследованных НПВП (9–45%). Таким образом, описанные ранее молекулярно-фармакологические эффекты ГС существенно дополняются основным действием всех НПВП – ингибированием ЦОГ2.
Воздействие ГС и НПВП на метаболизм лейкотриенов более многогранно по сравнению с влиянием на ЦОГ2. Так, ГС в значительной мере ингибирует фермент арахидонат-15-липоксигеназу (41%, IC50=348 нМ), что сравнимо с эффектами большинства НПВП (62–65%). В то же время исследованные НПВП гораздо более эффективно могут ингибировать другие белки лейкотриенового метаболизма: арахидонат-12-липоксигеназу (0,7–73%), арахидонат-5-липоксигеназу (40–64%), и лейкотриеновый B4-рецептор 1 (0,9–24%). Иначе говоря, эффекты ГС и изученных НПВП в отношении ингибирования метаболизма лейкотриенов существенно дополняют друг друга.
Как отмечено выше, основным молекулярнофармакологическим эффектом ГС является ингибирование фактора транскрипции NF-kB, опосредующего провоспалительные реакции клеток (прежде всего отклик клетки на воздействие ФНОα). Хемореактомный анализ указал на существенное ингибирование ГС фактора NF-kB (42±27% в Т-лимфоцитах человека, линия клеток Jurkat, при концентрации 100 мкМ, IC50=151±149 нМ), что сравнимо с эффектами НПВП (от 56±27 до 71±27%, IC50=187–995 нМ). Напомним, что более высокое значение константы ингибирования IC50 соответствует более слабому ингибированию.
ГС ингибировал также экспрессию ФНОα, вызываемую бактериальными липополисахаридами (ЛПС; 21±20%, IC50=113±97 нМ), причем величина эффекта была сопоставима с таковой всех изученных НПВП (21–40%, IC50=39–170 нМ). ГС и НПВП проявляли сопоставимые эффекты при ингибировании стимулируемого ФНОα синтеза ИЛ1 и ИЛ6, активности MAP-киназы p38, обеспечивающей секрецию ФНОα, и активности ММП ADAM17, трансформирующей неактивный пробелок ФНОα в активную форму ФНОα (см. табл. 2) [12–14].
Хемореактомные оценки противовоспалительных эффектов ГС и НПВП на клетках в культуре по отношению к различным цитокинам показали, что ГС и НПВП проявляли сравнимые эффекты в отношении ингибирования А- и В-рецепторов ИЛ8. Исследованные НПВП существенно дополняли эффекты ГС при ингибировании экспрессии/секреции ИЛ5 (ГС – 0%, НПВП – 68–72%; рис. 2), ИЛ6 (ГС – 15%, НПВП – 30–89%), ИЛ1β (ГС – IC50>5000 нМ, НПВП – IC50=36–141 нМ).
Многие из анализируемых НПВП (кеторолак, мелоксикам, декскетопрофен, эторикоксиб), по данным хемореактомного анализа, были ассоциированы с ингибированием эффектов ИЛ6 – провоспалительного цитокина, который cинтезируется активированными макрофагами и Th2-лимфоцитами [15]. Избыточная продукция ИЛ6 вызывает аутоимунные повреждения суставов при ревматоидном артрите и активирует остеокласты, осуществляющие деградацию костной ткани [16]. Повышенный уровень ИЛ6 также соотносится с усилением болевых реакций [17], так что ингибирование действия ИЛ6 посредством изученных НПВП соответствует обезболивающему эффекту. В целом НПВП существенно дополняют эффекты ГС при воздействии на уровень и активность провоспалительных цитокинов.
ГС и НПВП проявляли сравнимые эффекты в отношении ингибирования C-C-хемокиновых рецепторов (ССR) 1-го типа (CCR1): ГС – 24%, НПВП – 8,5–38%; 4-го типа (CCR4): ГС – 4%, НПВП – 1,8–16%; одновременно НПВП существенно дополняли эффекты ГС при ингибировании активности CCR типа 2 (CCR2): ГС – 17%, НПВП – 21–49% и типа 5 (CCR5): ГС – 9%, НПВП – 15–36% (рис. 3).
Напомним, что CCR существенно отличаются по реакции на различные провоспалительные хемокины и типам клеток, в которых они экспрессируются. Так, CCR1 осуществляет эффекты провоспалительных хемокинов CCL4, CCL5, CCL6, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23 в периферических лимфоцитах и моноцитах; CCR4 – эффекты провоспалительных хемокинов CCL3, CCL5, CCL17, CCL22 в Th2-лимфоцитах и дендритных клетках [18]; CCR2, который встречается в моноцитах, активированных Т-клетках памяти, моноцитах, В-клетках и базофилах, – эффекты хемокинов CCL2, CCL8, CCL16. CCR5 активируется хемокинами CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CCL13, CCL14, CCL16 и функционирует в дендритных клетках, CD34+ клетках и Th1-лимфоцитах [19]. Ингибирование CCR1, CCR2, CCR4, CCR5 молекулой ГС в сочетании с молекулами НПВП будет существенно ослаблять эффекты перечисленных провоспалительных хемокинов.
Хемореактомный анализ также показал, что рассмотренные НПВП существенно дополняли эффекты ГС с точки зрения ингибирования различных ММП. В среднем по различным типам ММП эффекты ингибирования ГС составили 12±12%, а эффект НПВП достигали 90% (рис 4.) Например, декскетопрофен ингибировал каждую ММП (ММП1, ММП2, ММП3, ММП9, ММП12, ММП13) в среднем на 46±33%.
Лечение заболеваний суставов часто проходит на фоне таких коморбидных состояний, как сахарный диабет 2-го типа (СД2), атеросклероз, артериальная гипертензия, тромбофилия и т. д. Поэтому очень важно оценить влияние нутриента ГС на обмен глюкозы, липидов, агрегацию тромбоцитов и состояние тонуса сосудов с точки зрения как безопасности, так и синергизма с НПВП. Хемореактомные оценки вазодинамических и антидиабетических эффектов ГС и НПВП в культурах клеток показали, что НПВП несколько более эффективны, чем ГС, для ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (в концентрации 100 мкМ): ГС – 15±8%, НПВП – 89–95%, IC50=1212±800 нМ для ГС и 193–367 нМ для НПВП.
В то же время хемореактомный анализ показал, что эффекты ГС при ингибировании биосинтеза холестерина были сопоставимы с эффектами изученных молекул НПВП: ГС – 20,8±16%, НПВП – 33–47%. Аналогично эффекты ГС и НПВП были сопоставимы и при оценке влияния на увеличение всасывания глюкозы в инсулинорезистентных клетках: для ГС EC50=424±1453 нМ, для НПВП ЕС50=527–2977 нМ. Эффекты ГС в отношении биосинтеза холестерина и переработки глюкозы ассоцированы, по всей видимости, с активацией рецепторов пролифераторов пероксисом и ингибированием киназы mTOR. Например, активация рецептора пролифераторов пероксисом α в клетках линии HEK293 составила для ГС 19±18%, для НПВП – 9–50%.
Заметим, что имеющиеся результаты клинических исследований показывают, что долговременный прием микрокристаллического ГС полностью безопасен для пациентов с СД2. Например, в исследовании женщин с СД2 (n=407, длительность заболевания – более 6,5 лет, ИМТ≥27 кг/м2 ) долговременный прием микрокристаллического ГС (1500 мг/сут, 2,5 года) не приводил к сколько-нибудь достоверному повышению уровня гликированного гемоглобина (HbA1c) [20]. Более того, результаты настоящего хемореактомного анализа указывают, что ГС может даже улучшать метаболизм глюкозы. Ингибирование киназы mTOR (IC50=731±713 нМ для ГС и 145–1498 нМ для НПВП), помимо снижения инсулинорезистентности, также вызывает геропротекторный эффект (в том числе стимулирует увеличение продолжительности жизни модельных организмов), что важно учитывать при проведении геропротекторного анализа исследуемых молекул.
Таким образом, результаты дифференциального хемореактомного анализа показывают, что фармакологические эффекты ГС и НПВП могут существенно дополнять друг друга. Для выбора НПВП, с которым у ГС наблюдается наибольший синергизм, мы разработали специальную балльную шкалу, с помощью которой оценивали каждую из указанных выше фармакологических активностей. Шкала состоит из пяти разделов: 1) ингибирование белков метаболизма простагландинов и лейкотриенов; 2) ингибирование эффектов транскрипционного фактора NF-kB и ФНОα; 3) противовоспалительные эффекты на клетках в культуре по отношению к различным цитокинам; 4) ингибирование ММП; 5) вазодинамические и антидиабетические эффекты на клетках в культуре.
Сравнение эффектов ГС и НПВП по каждой из исследованных активностей осуществлялось по 3-балльной системе: 0 – ГС проявляет активность, не найденную у НПВП; 1 – эффект ГС сравним с эффектом НПВП; 2 – НПВП существенно дополняет эффекты ГС; 3 – НПВП проявляет активность, не выявленную у ГС. Расчет «баллов синергизма» для каждой из активностей по пяти разделам проводили с учетом статистических различий в значениях констант, полученных в результате проведения дифференциального хемореактомного анализа ГС и НПВП.
Как показала оценка по балльной шкале, наибольший синергизм наблюдается у ГС с декскетопрофеном и несколько меньший – с кеторолаком. Анализ распределений «балла синергизма» ГС и различных ПВП выявил, что наиболее часто показатель синергизма для декскетопрофена и кеторолака равнялся 2, т. е. НПВП существенно дополняет эффекты ГС, а для остальных НПВП – 1, т. е. эффект ГС сравним с эффектом НПВП (рис. 5, а). Суммарный «балл синергизма» также был максимален для декскетопрофена и кеторолака (рис. 5, б).
Анализ оценок синергизма ГС и НПВП по пяти разделам балльной шкалы также установил, что суммарная оценка по четырем из пяти разделов (кроме раздела 3 – противовоспалительные эффекты на клетках в культуре по отношению к различным цитокинам) была максимальной именно для декскетопрофена (рис. 5, в). В случае раздела 3 суммарный балл для декскетопрофена и кеторолака был одинаковым (25 баллов) и превышал значения для остальных НПВП.
Результаты оценки сочетанного действия ГС и НПВП на различные маркеры воспаления (в частности, ингибирование активности NF-kB, ЛПС-индуцированной экспрессии ФНОα и ИЛ6, активности ММП ADAM17, активирующей ФНОα) приведены на рис. 6.
Продемонстрированы профили синергизма, характерные для каждого из исследованных сочетаний ГС и НПВП. Например, кеторолак более или менее одинаково влияет на каждый из анализируемых маркеров, а декскетопрофен и эторикоксиб – в существенно большей степени ингибируют NF-kB и ИЛ6 и т. д.
Таким образом, все исследованные молекулы НПВП в сочетании с ГС продемонстрировали синергичное влияние на основные маркеры воспаления. Этот результат указывает на целесообразность применения ГС в комплексе с изученными НПВП.
Проведенный ранее хемореактомный анализ декскетопрофена выявил его дополнительные свойства, не найденные у молекул сравнения [12]. Эти особенности декскетопрофена могут обусловливать наибольшую степень его синергизма с ГС. Во-первых, среди НПВП именно декскетопрофен наиболее выраженно ингибировал ЦОГ2 (в концентрации 10 мкМ, клетки sf-9, см. табл. 1): ингибирование составило 90,9±31%, для остальных НПВП – 35–77±31%). Во-вторых, только для декскетопрофена показана возможность конкурентного ингибирования D2-рецептора простагландина (IC50=1235±913 нМ), который непосредственно опосредует эффекты провоспалительного простагландина D2 (ПГD2). Как известно, ПГD2 содержится преимущественно в тучных клетках и мозге [13], являясь основным медиатором вазомоторной гиперемической реакции верхней части тела в ответ на прием никотиновой кислоты (ниацин). Избыточная активация D2-рецепторов характерна для бронхиальной астмы и стимулирует развитие алопеции [14]. В-третьих, именно для декскетопрофена была наиболее характерна модуляция метаболизма провоспалительных лейкотриенов посредством ингибирования арахидонат-5-липоксигеназы (на 64% при концентрации 10 мкМ, остальные НПВП – 0–55%) и рецептора-1 лейкотриена (на 24% при 10 мкМ, остальные НПВП – 0–23%, см. табл. 1). В-четвертых, среди исследованных НПВП декскетопрофен проявлял наиболее выраженные ингибирующие свойства по отношению к различным ММП. Суммарный балл ингибирования ММП был наиболее высоким именно для декскетопрофена (см. рис. 5, б). Известно, что избыточная активность ММП соответствует ускоренной деградации коллагеновых и эластиновых волокон соединительной ткани, что наблюдается при активации процессов воспаления в соединительной ткани кости и хряща.
Представленные в работе [12] результаты хемопротеомного анализа декскетопрофена указывают на существенно различные профили взаимодействия декскетопрофена и других НПВП с различными видами ферментов-цитохромов Р450, которые метаболизируют поступающие в организм вещества. Декскетопрофен может снижать активность только четырех цитохромов: CYP17A1, CYP3A5, CYP4B1 (метаболизм стероидов) и CYP2D6 (метаболизм антиаритмиков, антагонистов адренорецепторов, антидепрессантов). В то же время такие НПВП, как, например, кетопрофен или диклофенак, воздействуют на гораздо более широкий диапазон цитохромов Р450, что негативно сказывается на метаболизме стероидов, омега-3 полиненасыщенных жирных кислот и витамина D [12].
Выводы. Перспективным направлением в терапии патологии суставов является совместное использование ГС (Сустагард® Артро) и НПВП. При этом очень важно выбрать наиболее эффективную комбинацию этих препаратов.
Применение метода хемореактомного анализа позволило оценить степень синергизма ГС и НПВП на молекулярном уровне. Во-первых, все исследованные молекулы НПВП (кеторолак, нимесулид, диклофенак, мелоксикам, декскетопрофен, целекоксиб, эторикоксиб) в сочетании с ГС демонстрируют более выраженное действие на различные маркеры воспаления, что подтверждает синергизм ГС и НПВП. Во-вторых, результаты дифференциального хемореактомного анализа позволяют утверждать, что из исследованных молекул НПВП декскетопрофен (и в меньшей степени кеторолак) наиболее эффективно дополняют фармакологические свойства ГС.
Для использования на практике может быть рекомендован следующий подход: на 1-й неделе лечения для быстрого устранения болевого синдрома назначается наиболее эффективная комбинация – ГС + декскетопрофен (либо ГС + кеторолак), после чего можно использовать комбинацию ГС с НПВП, прием которого в течение более длительного времени сопряжен с минимальными побочными эффектами.
ЛИТЕРАТУРА
Поступила 25.03.2018
Исследование поддержано ЗАО «Фармфирма «Сотекс». Авторы несут полную ответственность за предоставление окончательной
версии рукописи в печать. Все авторы принимали участие в разработке концепции статьи и написании рукописи.
Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами